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(检测类)技术服务

原核蛋白表达体系
高效表达菌株,大大提高蛋白可溶表达几率!
公司新闻

1、热烈祝贺钟山生命科学园更名,园区环境大幅改善。

2、2015年12月,钟鼎生物正式获批“企业研究生工作站”,“江苏省高科技企业”等一系列称号。

3、2015年8月,钟鼎生物正式获批“国家级高新科技企业”殊荣。more

抗体重组表达服务-(CHO细胞及293细胞系)  

    抗体药物最终应用于人体,抗体序列不可避免的面临人源化问题,因此获得安全的、稳定的、高效率的接近天然的重组抗体至关重要,对于常规的多克隆或单克隆抗体制备技术来说,几乎是不可能逾越的难题。重组抗体表达技术使制备人源化抗体和人源抗体成为水到渠成的工作。
    抗体药物工程是一类交叉领域的复杂工程,涵盖生物信息学、药理学、代谢组学、分子生物学、免疫学、蛋白表达纯化技术等多学科范畴,钟鼎生物在整个环节中,扮演的最擅长的基于蛋白重组表达的角色,因为专业,我们才可以把工作做到极致!

抗体重组表达服务种类

杆状病毒-昆虫细胞蛋白表达服务概述

    钟鼎生物拥有完善成熟的哺乳动物蛋白表达平台,结合抗体纯化、亚型鉴定、抗体测序、重组抗体亲和力成熟(如需服务请参考相关案例文件)等先进平台能为客户提供优质的重组抗体表达服务,包含鼠源单克隆抗体构建及表达、更换恒定区亚型的嵌合抗体表达,抗体人源化改造及表达等服务。

  1. 钟鼎拥有专门的哺乳动物细胞蛋白表达实验平台和抗体制备技术平台,可以实现实验无缝对接,让项目一体化,流程均一化
    成为可能,在时效上和质量上有保证。
  2. 丰富的抗体表达载体资源让我们的抗体表达服务如虎添翼,只需要提供重链及轻链可变区序列,亚克隆至特定的表达载体
    中,即可开始表达项目。最重要的是,我们免费提供哦!
  3. 成熟的序列优化技术,配合HEK293改良细胞系,最大程度激发表达潜能,常规瞬时转染小试产量在10~100mg/L,小试高产量
    有利于节约成本,提高商业化应用潜能。
抗体重组表达平台
钟鼎生物重组抗体表达平台属于国内领先的服务平台,以首席科学家Dr.Louis领衔的技术团队拥有超过20年的哺乳动物蛋白表达经验和免疫学背景,我们配套了标准的万级细胞房,使用非动物源性培养基,全流程使用进口试剂耗材,在获得了抗体轻(重)链可变区的前体下,为了获得高产量的,高特异性的重组抗体蛋白,我们会在多个方面进行资源调配和合理优化,获得的每一管抗体蛋白都经过严格的质量评价。

重组抗体蛋白表达设备及实验室

  1. 根据抗体亚型和应用要求,选择恰当的恒定区骨架质粒。目前,我们可以提供小鼠、人、兔等物种的的恒定区骨架质粒,通过重组无缝克隆方式将可变区基因连入表达载体,无需客户重新基因合成或调取。可变区测序时,尽可能挑取多个阳性克隆,确认序列无误。
  2. 我们筛选出来有多条高效率的抗体分泌信号肽,一般情况下我们使用来自于利钠肽V5高效信号肽进行分泌表达,当抗体部分泌或产量偏低时,我们可能会设计并构建多种信号肽的表达质粒平行试验,筛选最佳的信号肽方案。
  3. 配合我们的抗体表达质粒,我们会有针对性的选择293和CHO相关细胞系,并摸索最佳的细胞转染条件,实现转染试剂品牌与用量、细胞培养成本、表达量的最佳配比,以期达到最经济科学的实验条件。
  4. 常规实验设计中,我们根据FC的信息会选择Protein A/G对重组抗体进行纯化,不会添加额外的融合标签,对于高纯度要求的抗体,使用AKATA进一步纯化,根据纯度和量的要求额外加收费用。
  5. 常规的科研级别抗体表达订单中,客户可免费使用我们的表达体系,但我们最终只交付抗体终产物,不赠送表达体系及关键的技术信息。(合作开发项目另议交付标准)

钟鼎生物抗体表达载体列表

产品编号 载体名称 载体骨架说明 纯化方案
AVH-1101 pAZ-V5-hCH-IgG1 Human IgG1 重链恒定区 Protein A / G
AVH-1102 pAZ-V5-hCH-IgG2 Human IgG2 重链恒定区 Protein A / G
AVH-1103 pAZ-V5-hCH-IgG3 Human IgG3 重链恒定区 Protein A / G
AVH-1201 pAZ-V5-hCH-IgM*3 Human IgM(allele 3) 重链恒定区 Protein G
AVH-2101 pAZ-V5-hCL-IgGκ Human IgGκ 轻链恒定区 *
AVH-2102 pAZ-V5-hCL-IgGλ1 Human IgGλ1 轻链恒定区 *
AVH-3106 pAZ-V5-h-IgG1Fc Human IgG1 Fc片段 Protein A
AVM-1101 pAZ-V5-mCH-IgG1 Mouse IgG1 重链恒定区 Protein A / G
AVM-1102A pAZ-V5-mCH-IgG2A Mouse IgG2 重链恒定区 Protein A / G
AVM-2101 pAZ-V5-mCL-IgGκ Mouse IgGκ 轻链恒定区 *
AVM-2102 pAZ-V5-mCL-IgGλ1 Mouse IgGλ1 轻链恒定区 *
AVM-3108 pAZ-V5-m-IgG1Fc Mouse IgG1 Fc片段 Protein A

 

抗体重组表达服务流程及报价
钟鼎生物抗体表达平台采取的是双质粒共转悬浮细胞为基础的实验策略,最终形成以自然结合成四聚体的天然构象蛋白,经过变性胶和非变性胶的双重检测,如果客户可以提供抗体特异性抗原,我们也可使用Western Blot检测。

抗体重组表达载体

 

抗体重组表达技术服务(基于293 CHO表达系统)

抗体重组表达步骤及交付标准
1、表达体系系统选择(客户提供表达质粒的请告知质粒信息及元件说明)
可选表达载体
pAZ-V5相关系列载体 其他商业化的载体
可选表达宿主
HEK293 CHO 或其他商业化的载体
2、载体构建 实验周期 交付数据及材料 报价
    A:序列分析优化
    亚克隆设计
    合成基因
    B:亚克隆至pAZ-V5系列载体

基因合成
2周左右
亚克隆
1-2周

1、基因合成报告
2、测序验证报告

重组抗体蛋白表达服务属于科研型服务项目,为了给您提供更专业、细致的服务支持

请联系order@zoonbio.com

免费电话
400-066-8086

或咨询QQ技术支持在线QQ技术支持2

3、细胞转染表达 实验周期 可交付数据及实验材料
    C:无内毒素质粒提取
    D:细胞瞬时转染
    E:表达小试,条件优化
    F:表达分析鉴定(SDS-PAGE)
    G:ELISA效价检测

细胞转染
1周
表达鉴定
1-2周

5、瞬时转染的细胞裂解液
(如提供需增加费用)
6、细胞上清小样
(如提供需备注说明)
7、表达分析报告

4、纯化抗体鉴定 实验周期 交付数据及实验材料
    H:Protein A/G亲和纯化
    I:重组抗体鉴定
表达鉴定
1-2周
8、纯化、分析鉴定报告
9、重组蛋白(10 -100ug,85%纯度)
5、放大培养及蛋白纯化 实验周期 交付数据及实验材料
    J:放大培养(1-2L)
    K:Protein A/G亲和纯化
    L:纯化抗体检测
    M:抗体分装发货
放大培养
2-3周
表达纯化
1-2周

10、蛋白纯度鉴定报告
11、成品蛋白(依据表达小试结果约定)

 

重组抗体蛋白表达案例

本案例基于pAZ-V5+293T分泌表达体系,使用基因合成的方法合成重链和轻链的可变区,分别将可变区通过重组克隆的方式构建至pAZ-V5-hCH-IgG1和pAZ-V5-hCL-IgGκ表达载体,通过双质粒瞬时转染HEK293悬浮细胞,经过通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况,经过表达验证后,扩大培养收集细胞上清并通过protien A亲和柱的亲和纯化获得目的蛋白。本案例所涉及数据及实验方法结论,未经钟鼎生物授权,任何单位及个人不得转载或盗用,违者必究!

一、实验设计
我们分析客户提供的重轻链理论序列,符合理论分子量大小,抗体蛋白也无跨膜等特殊结构,因此我们设计思路为:
1.1、以客户的基因序列翻译的蛋白序列为源模板,通过密码子优化一套最适宜HEK293T细胞系的基因序列。
1.2、推荐客户使用钟鼎生物的自主载体pAZ-V5-hCH-IgG1和pAZ-V5-hCL-IgGκ载体来进行实验,利用载体自带的V53信号肽序列帮助蛋白穿膜分泌表达至胞外,重轻链蛋白在细胞上清中形成二硫键,组装成四聚体结构。
依据上述设计思路,以基因合成的方式构建pAZ-V5-hCH-IgG1和pAZ-V5-hCL-IgGκ质粒,经过测序和酶切验证无误后,提取无内毒素的质粒。转染200ml HEK293T细胞,通过western blot检测蛋白表达情况,确认蛋白表达情况,再通过Protein A亲和纯化获得80%以上目的蛋白。

二、试剂和耗材(略),培养基配方如下(略)

三、主要实验仪器 (略)

四、实验分析及设计
4.1 抗体重轻链可变区序列获得(抗体测序项目请参考单独的实验案例文件)
针对基因序列分析稀有密码子情况,分析可变区蛋白序列的跨膜结构和亲疏水性,从而决定载体设计的实验方案,由于篇幅限制,此处不做详细的累述。我们专业的技术支持会依据您提供的信息免费分析并设计实验方案。

蛋白分析

五、实验方法及实验结果
5.1 pAZ-V5-hCH-IgG1表达质粒构建(pAZ-V5-hCL-IgGκ流程相似,此处略)
采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成重链可变区基因,重组克隆连接至pAZ-V5-hCH-IgG1载体的;将获得的重组质粒转入TOP10克隆菌株,挑取阳性克隆子测序,测序结果拼接如下所示(序列略),载体结构如下;

载体

5.2 使用Chromas软件查看测序峰图文件,截取部分序列示例如下

重组抗体蛋白基因测序

测序拼接序列与理论序列相比对,结果显示获得序列与理论序列100%匹配,比对文件截图如下所示
重组抗体蛋白基因对比

5.3 pAZ-V5-hCH-IgG1质粒酶切图与载体构建示意图如下所示:

载体构建

5.4.1. 无内毒素质粒抽提
使用Sigma公司Endotoxin Free质粒重量抽提试剂盒抽提p表达质粒,经LAL法测定<0.1EU/ug。
5.4.2. 待转染细胞预处理
转染前一天,将形态良好、生长旺盛处于对数生长期的HEK93T细胞用胰蛋白酶消化后稀释至4×105/mL的密度,接入24孔细胞培养板,轻微振荡使细胞均匀铺在细胞板孔内,每孔500ul,用DMEM高糖培养基培养和传代细胞。平放在37℃、5%二氧化碳培养箱中培养,待细胞长至80-90%汇合度时,可以开始转染操作。
5.4.3 细胞转染
取0.8ug质粒,加入50ul Optipro SFM,混匀后加入2ul 转染试剂,再次混匀后室温孵育20min。将DNA-转染试剂复合物滴加至24孔板中,轻轻混匀,37℃培养箱培养48h。
5.4.4 Western Blot检测培养上清(客户提供待测抗原)
样品上样0.01ug,上样完毕后,聚丙烯酰胺凝胶先90V跑完积层胶,再将电压升至200V直到电泳结束。电泳结束后,取下凝胶进行转膜,恒压100V转膜,约为1.5小时。取下膜后先用PBS洗涤4次,每次5分钟。然后置于5%脱脂奶粉封闭液中封闭37℃ 1小时。用封闭液稀释一抗,膜在一抗稀释液中37℃反应1小时。 洗膜4次,每次5 分钟;用含5%牛奶的封闭液稀释二抗。膜在二抗中37℃反应1小时,洗膜ECL显影。
5.5.1待转染细胞准备
将处于对数生长期的293T细胞用Trypsin消化后稀释至4×105/mL的密度,种于2L的滚瓶中。每个滚瓶加200ml DMEM高糖培养基(含3%胎牛血清),调节滚瓶转速至20转/小时,使细胞均匀贴到转瓶表面,约24小时左右,当细胞贴壁面汇合至90%时进行转染。
5.5.2 DNA预处理
取100ug无内毒素质粒,加入13ml OptiSFM,混匀后加入250ul 转染试剂,再次混匀后室温孵育20min。
5.5.3 细胞转染与表达
将DNA-转染试剂复合物滴加至滚瓶中,轻轻混匀,调节滚瓶转速20转/小时 ,37℃培养箱培养10个小时后换3% 血清的 DMEM中糖500ml,调节滚瓶转速40转/小时。表达4天后收取上清。
5.5.4 重组抗体纯化
准备ProteinA纯化柱,用5-10倍柱体积的PBS平衡柱子。细胞上清以1ml/min的速度上样至ProteinA柱。用20 mM PB缓冲液以0.5 ml/min流速洗脱杂样,至流出液OD280值到达基线。洗脱在蛋白值至核酸蛋白检测仪数值稳定不变时准备洗脱。用Elution-Buffer(0.1M Nacl, 0.1M 甘氨酸, pH 3.0) 以1 ml/min流速洗脱目的抗体,收集流出液,并用PH9.0 Tris- HCL使其pH值恢复至中性,将收集的抗体溶液加入透析袋中,用20 mMPBS(PH7.4)透析过夜,透析后的样品进行SDS-PAGE纯度分析和BCA浓度检测。

抗体表达结果验证

补充说明:
1、正常情况下,抗体蛋白的表达量都比较可观,但是某些突变序列产量会偏低,因此我们蛋白交付量跨度较大。
2、一般我们使用还原性和非还原性电泳检测重组抗体,如果客户需要验证抗体的特异性,需提供额外抗原使用WB检测。
3、我们使用哺乳动物细胞表达获得重组抗体,我们只承诺蛋白序列与设计相符,不承诺重组抗体具有客户预期的生理活性。
4、即使蛋白不表达或表达量极低,我们无法获得目的蛋白,我们也会提供全套的实验流程和原始照片。

选择钟鼎生物,会为您的项目增色,我们的专业外包服务团队将帮助您解放双手,开拓思维,用更多的精力去碰撞思想的火花,选择钟鼎的理由远远不止四条,我们期待您的惠顾!

钟鼎生物资质

 

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