当前位置:首页技术服务定制类技术服务重组蛋白表达技术服务毕赤酵母蛋白表达
(定制类)技术服务
(检测类)技术服务

酵母表达体系
多种载体可供选择,马上咨询吧!
公司新闻

1、热烈祝贺钟山生命科学园更名,园区环境大幅改善。

2、2015年12月,钟鼎生物正式获批“企业研究生工作站”,“江苏省高科技企业”等一系列称号。

3、2015年8月,钟鼎生物正式获批“国家级高新科技企业”殊荣。more

毕赤酵母蛋白表达服务

  酵母P. Pichia 表达系统是工业微生物中应用较广泛的系统,兼有了原核表达的周期短、成本低廉、易操作等优点,易于工业级别放大培养;同时具备了真核细胞对蛋白的空间折叠,糖基化修饰等能力,使得蛋白可溶性大幅度提高,为研究蛋白的生理活性提供了强有力的工具。
  酵母蛋白表达实验过程中,影响实验结果因素很多,诱导时间、诱导温度、目的基因拷贝数、培养条件以及鉴定方法等,都会导致实验结果的区别。任何小小的疏忽,几个月的辛苦将付诸东流,钟鼎生物技术人员具有丰富的经验,能够最大限度发掘酵母菌株的表达潜能,提高表达成功率和表达水平。

钟鼎酵母表达载体说明

  生命科学进入后基因组时代,在许多科研项目中,获得具有空间结构和生物学活性的重组蛋白是非常关键的步骤。虽然原核体系也能获得蛋白,但是由于宿主系统的限制,依然有很大一部分重组蛋白没有活性。
  毕赤酵母体系是真核体系中操作简单、成本低廉的系统,在蛋白加工、折叠、翻译后修饰等方面具有诸多优势,在毕赤酵母体系中蛋白转录后糖基化所增加的寡糖链长度(平均每个支链8-14 个甘露糖残基)非常接近高等真核生物的结构,活性几率大大高于原核体系。
  钟鼎生物具有丰富的宿主细胞资源和载体选择经验,同时改造并开发了的GAP启动子的创新pYE-GAPα载体。进一步改善了蛋白诱导表达的操作步骤,无需在诱导过程中更换培养基,也无需在表达过程中检测甲醇含量,有效的提高细胞密度及蛋白产量。

钟鼎酵母细胞系统蛋白表达服务实验步骤及交付标准

毕赤酵母体系蛋白表达实验步骤及交付标准
1、表达体系系统选择(客户提供表达菌株的略过此步骤,仅提供表达质粒的可选择需要电转化的表达菌株)
1.1、可选表达载体
GAP启动子载体:pYE-GAPα,;
常规商业化载体:分泌表达:pPICZαA、pPIC9K,
胞内表达:pPICZA、 pPIC3.5K
1.2、可选表达菌株
GS115,X33菌株
SMD116蛋白酶缺失型菌株
2、毕赤酵母表达载体构建 交付材料及数据 实验周期 价格
A:基因优化
亚克隆设计
合成基因
B:亚克隆至载体
C: 质粒中抽及线性化-10ug
1、基因合成报告
2、测序验证报告
3、包含表达质粒的大肠杆菌DH5a
4、表达质粒
5、线性化检测图片
基因合成
2周左右
亚克隆
1-2周
线性化 2-3天

酵母蛋白表达服务属于科研型服务项目,为了给您提供更专业、细致的服务支持

请联系order@zoonbio.com

免费电话
400-066-8086

或咨询QQ技术支持
在线QQ技术支持

3、毕赤酵母蛋白表达鉴定 交付材料及数据 实验周期
D、电击转化
E、阳性克隆子筛选(PCR法)
F、高拷贝菌株筛选(可选)
G、表达小试(5-10菌株)
H、表达分析鉴定(Dot杂交)
I、定株,优化表达条件
6、阳性表达菌株
7、PCR鉴定阳性菌株图
8、高拷贝阳性菌株(可选)
9、小试表达流程报告
10、Dot Blot实验结果
11、小试表达总结
电转化及鉴定
1-2周
高拷贝筛选
2-3周(可选)

表达小试及鉴定
1-2周
4、毕赤酵母蛋白纯化及鉴定 交付材料及数据 实验周期
J、放大培养2-5升
K、表达上清液浓缩
L、Ni柱低压亲和纯化
M、PAGE分析纯化过程
N、WB鉴定纯化后蛋白
O、PFM检测(可选)
P、MS检测(可选)
12、蛋白纯化流程报告
13、蛋白纯化原始图片
14、发货蛋白
15、Western Blot(标签抗体)
16、蛋白指纹图谱(可选)
17、蛋白质谱分子量(可选)

放大培养
2-3周
蛋白纯化
1-2周
WB 1周
PMF 2-3周
MS 1-2周
说明:毕赤酵母细胞对密码子偏爱性要求较高,建议进行基因优化后再进行表达以提高成功率
1、正常情况下采用分步收费原则来收取费用,特殊订单承诺不成功不收费(详情请咨询公司技术支持 400-066-8086)
2、不同的蛋白表达量差异很大,我们会尽量提供mg级别以上的蛋白量给客户。
3、即使订单失败,我们也会提供全套的实验流程和原始照片,并将表达菌株及表达质粒返还给客户。

合同模板下载

酵母系统蛋白表达技术服务 酵母系统蛋白表达技术服务合同模板 QQ技术支持2 专业的酵母系统蛋白表达技术支持为您服务

毕赤酵母蛋白表达服务案例

本案例基于钟鼎生物酵母表达质粒pYE-GAPα,使用基因合成的方法构建胞外分泌型表达载体,电转毕赤酵母表达宿主,通过WB检测上清中蛋白的表达情况,并最终获得目的蛋白。未经钟鼎生物授权,任何单位及个人不得转载或盗用。

毕赤酵母蛋白表达订单前分析工作:
我们会使用钟鼎生物专用的Codon_Score2.0软件分析了酵母蛋白的基因序列,其中绿色是频率正常的密码子(使用频率>20%),灰色是使用频率低于20%的密码子,红色表示使用频率低于10%的密码子,同时针对酵母宿主细胞优化基因序列。同时会对蛋白的亲疏水性和跨膜结构域分析,在不影响功能的基础之上,会选取部分或者全部的蛋白序列表达,制定表达成功率最高的实验方案。

毕赤酵母蛋白表达前分析

一、实验设计
依据客户提供的蛋白序列,优化密码子使之更适宜在毕赤酵母中表达,采用全基因合成的方法合成基因XXX,经目的基因亚克隆至pYE-GAPα载体的多克隆位点区域,N端携带6XHis标签蛋白,获得的质粒经酶切及测序验证无误后,中抽质粒利用AVr II线性化重组质粒pYE-GAPα-XXX,电转化毕赤酵母SMD1168菌株,挑选5-10株阳性克隆,并通过PCR验证,选择3-5株阳性菌株进行表达,通过Dot-Blot验证其表达情况,定株后选用1株放大培养。按照实验预期:细胞培养过程中,XXX-His蛋白将会分泌表达至培养基中,通过SDS-PAGE电泳检测及WB验证目的蛋白的表达情况,通过Ni柱的亲和纯化,获得XXX-His蛋白。

二、试剂和耗材(略),培养基配方如下(略)

三、主要实验仪器 (略)

四、实验方法及结果
1、pYE-GAPα-XXX质粒构建
采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成基因,双酶切连接pYE-GAPα-XXX的EcoR I和Not I;挑取阳性克隆子测序,测序结果如下所示,单划线区域为该基因区域,其中红色字体为6xHis标签,蓝色字体为EK酶切位点。(序列略)
使用Chromas软件查看测序峰图文件,截取部分序列示例如下
酵母表达质粒测序

测序拼接序列与理论序列相比对,结果显示获得序列与理论序列100%匹配,比对文件截图如下所示
酵母表达质粒序列比对

pYE-GAPα-XXX质粒酶切图与载体构及建示意图如下所示
酵母表达质粒检测及线性化

2、pYE-GAPα-XXX质粒线性化, 抽提质粒10ug左右,使用AVr II线性化, 冻干浓缩待用,检测结果如上右图所示。

3、酵母感受态细胞制备:
1、取100ul菌液,接入到装有10 mL YPD液体培养基试管中,30℃,280 rpm过夜培养。
2、将3mL过夜培养液接入到50mLYPD液体培养基的三角瓶中,30℃,280 rpm培养至OD值1.3-1.5之间,待用。
3、在无菌操作台内将上述菌液倒入到灭过菌的离心管中,5000rpm、4°C离心5min,弃上清,用50 mL冰浴无菌水重悬菌体。
4、5000rpm、4°C离心5min,弃上清,用25 mL冰浴无菌水重悬菌体。
5、5000rpm、4°C离心5min,弃上清,用10 mL冰浴的1M山梨醇溶液重悬菌体。
6、5000rpm、4°C离心5min,弃上清,用400uL冰浴的1M山梨醇溶液重悬菌体。
最终得到500ul毕赤酵母感受态细胞,分装成80Ul/管备用,感受态细胞一般现做现用以确保电转效率更高。

4、电转酵母细胞
1、冰浴电转杯,将10uL线性化质粒pGAPZaA-0620加入到装有80uL毕赤酵母感受态酵母细胞的1.5mLEP管内,混匀后加入到直径为0.2 cm电转化杯中,将310uL等渗溶液加入到电转化杯中,然后把电转杯冰浴5min。
2、电击条件为:电压1700V、时间8mS、电击2次。
3、电击完成后,将1mL冰上预冷的浓度为1M山梨醇溶液加入到电击转化杯里,用枪头轻轻地吹打溶液均匀。把电转杯中的全部液体转移到新的2ml EP管中,30度静置培养2h。分别吸取50ul、100uL和200uL线性化质粒pGAPZaA-0620的混合液涂布于100ug/ml Zeocin抗生素YPD平板上,30度恒温培养48小时,待平板长出菌落,用接种环挑取平板上生长的单菌,将它接入到装有10ml YPD液体培养基试管中(抗生素Zeocin浓度100ug/ml),30度,180rpm过夜培养。(高拷贝筛选需额外进行单独的实验操作,此处省略)

酵母表达细胞转化

5、PCR鉴定阳性克隆菌株
挑选10株阳性克隆,分别提取基因组DNA,使用5’pGAP priming和 3’AOX1 priming引物PCR鉴定结果如下下图所示,结果显示均为阳性,按照预期,目标条带应该在1.5K左右。

6、小试表达
1、取上述鉴定阳性的表达菌株(1-10号菌株)分别接入装有9ml YPD(抗生素Zeocin 200ug/mL)的试管中,30度、220rpm培养24h
2、取24h培养菌种500uL接入到50ml YPD(抗生素Zeocin 200ug/mL)液体培养基中,30度、220rpm培养,48后h从培养基中取样,10000rpm、2min离心收集上清液,
3、分别对10份菌株的表达上清使用Dot-Bot(anti-his抗体)检测,查看实验结果。(Dot-Blot实验结果案例见上页图5)
4、经过Dot-Blot实验分析,大部分克隆表达呈阳性,其中1号菌株阳性信号最强,使用1号菌株放大培养。

毕赤酵母蛋白表达

7、放大培养及纯化
1、挑选表达最明显的1号菌株放大至1L体系(YPD培养基 Zeocin 200ug/ml),30度、220rpm培养,72小时收集上清培养液。
2、72小时发酵液浓缩后以0.5 ml/min流速上样至利用低压层析系统,通过Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA -Sepharose CL-6B亲和层析柱
3、用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 ml/min流速冲洗,至流出液OD280值到达基线;
4、用Ni-IDA Washing Buffer(20 mM Tris-HCl,20 mM咪唑,0.15 M NaCl,pH8.0)以1 ml/min流速冲洗,至流出液OD280值到达基线
5、用Ni-IDA Elution-Buffer(20 mM Tris-HCl,250 mM咪唑,0.15 M NaCl,pH8.0)以1 ml/min流速洗脱目的蛋白,收集流出液
6、将上述收集的蛋白溶液加入透析袋中,使用PBS(PH7.4)进行透析过夜后进行SDS-PAGE分析。

8、蛋白质鉴定
对纯化后的蛋白,依据合同约定,进一步验证蛋白质的正确性,可选的方法有western blot, MS(分子量质谱),PFM(肽指纹图谱)具体的实验案例请参照对应的服务项目,此处省略。

补充说明:
依据我们的大量实践经验表明:利用酵母体系进行蛋白表达,蛋白表达成功率相对原核表达体系及偏低。在实验室的摇瓶状态下,受培养条件,特别是溶氧量的限制,很难实现高细胞密度培养,因此单位体积的产量偏低,很多时候甚至无法纯化或纯化成本极高,因此我们无法具体的承诺交付的蛋白量,最终会依据培养的体积来纯化并交付蛋白。另外,酵母分泌的蛋白经过高尔基体的细胞器的修饰,会有糖基化、二硫键、三级结构等,其表观分子量往往会稍微偏大于理论分子量。

钟鼎生物资质

猜您所需

DNA/RNA核酸提取服务 反转录RT-PCR钓取基因 同工酶检测分析 蛋白质解析 质粒抽提服务 蛋白HPLC纯度分析 哺乳动物细胞蛋白表达 原核蛋白表达服务

更多服务直接电话联系技术支持 400-066-8086,Email至 order@zoonbio.com咨询,或在线咨询:QQ技术支持2 QQ技术支持3