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哺乳动物体系的蛋白表达
用真心为您提供真核表达服务!
公司新闻

1、热烈祝贺钟山生命科学园更名,园区环境大幅改善。

2、2015年12月,钟鼎生物正式获批“企业研究生工作站”,“江苏省高科技企业”等一系列称号。

3、2015年8月,钟鼎生物正式获批“国家级高新科技企业”殊荣。more

哺乳动物细胞系统瞬时蛋白表达服务  

    哺乳动物细胞系统蛋白表达是广为应用的人类复杂糖基化蛋白的表达系统,也是活性蛋白因子及各类受体蛋白的最佳表达系统,在蛋白表达过程中会形成接近天然蛋白的蛋白质折叠和聚合,具备活性蛋白所必须的空间结构和修饰,60%以上的的药用蛋白产品由哺乳动物细胞表达系统获得。在科研领域,为了获得有活性的重组蛋白,哺乳动物细胞表达系统是首选方案。

哺乳动物细胞蛋白表达_CHO/HEK293

     钟鼎生物的哺乳动物表达体系以CHO(中国仓鼠卵巢细胞系统)和HEK293(人胚肾细胞系统)为表达宿主,筛选了高效的真核表达载体pMZ-X3(基于CMV启动子体系),为用户提供瞬时转染的哺乳动物细胞表达服务,制备mg级别的真核细胞重组蛋白,用于小规模实验应用及检测。

钟鼎哺乳动物细胞蛋白表达服务特色

1、自主构建的pMZ-X3高效表达载体,含CMV启动子,Kozak序列、X3信号肽及6XHis标签,可实现高效分泌表达,利于重组蛋白的纯化与检测。同时携带Neomycin抗性基因,可通过G418筛选稳定高表达细胞株。
2、 ATCC原装进口的细胞株HEK293,传代次数15以内,遗传背景清晰,配合pMZ-X3质粒,转染效率在85%以上,无血清培养基进一步减少动物蛋白污染。
3、 拥有独立的万级细胞房,4台细胞生物反应器,可同时进行贴壁与悬浮的细胞培养。单个实验台独立操作,避免交叉污染。
4、常规低压层析系统可用于带有标签的重组蛋白亲和纯化,另外配套的AKATA纯化设备,可利用离子交换、分子筛等手段可以纯化无标签蛋白,提供纯度大于95%以上的蛋白制品。
5、蛋白质理化检测平台可提供重组蛋白的分子量、肽指纹图、N端测序分析;免疫学检测平台可以通过Western Blot方法、蛋白互作等方法进一步确认蛋白的理化及生物性质。

哺乳动物细胞表达载体pMZ-X3

哺乳动物细胞蛋白表达服务

哺乳动物体系有很多的先天优势,获得天然修饰蛋白的概率大大增加,钟鼎生物配套的cDNA文库、蛋白设计分析服务,以及表达方案,有助于提高蛋白表达的成功率和产量。
如果您需要mg级别的小量蛋白,我们推荐使用pMZ-X3体系瞬转HEK293细胞;如果需要构建稳定表达的细胞株,推荐使用pMZ-X3体系瞬转CHO细胞后通过G418筛选高表达的稳定细胞株。

哺乳动物细胞表达步骤及交付标准
1、表达体系系统选择
可选表达载体
pMZ-X3相关系列载体(分泌型、可选His-tag)
其他商业化的载体
可选表达宿主
HEK293系列细胞 CHO系列细胞 (根据不同要求,我们会选择贴壁型或悬浮型的细胞完成实验) 其他商业菌株
2、表达载体构建 周期 交付数据及材料 报价
  • 基因分析
  • 亚克隆设计
  • 合成基因
  • 亚克隆至载体pMZ-X3

基因合成
2周左右
亚克隆
1-2周

1、基因合成报告
2、测序验证报告
3、包含表达质粒的大肠杆菌DH10
4、表达质粒

哺乳动物细胞蛋白表达服务属于科研型服务项目,为了给您提供更专业、细致的服务支持

请联系order@zoonbio.com

免费电话
400-066-8086

或咨询QQ技术支持在线QQ技术支持2

3、瞬时转染小试    
  • 无内毒素质粒提取
  • 细胞瞬时转染
  • 表达小试,条件优化
  • 表达分析鉴定(SDS-PAGE)
  • Western Blot

细胞转染
1周

表达鉴定
1-2周

5、瞬时转染的细胞裂解液
(如提供需增加费用)
6、细胞上清小样
(如提供需提前备注说明)
7、表达分析报告
4、细胞上清纯化小试    
  • Ni柱亲和纯化
  • 重组蛋白鉴定检测
表达纯化检测
1-2周
蛋白样品 (可提供50-500ug蛋白)
5、放大培养及蛋白纯化    
  • 放大培养(1-2L)
  • Ni柱亲和纯化
  • 纯化蛋白检测
  • 蛋白分装发货
放大培养
2-3周
表达纯化
1-2周

8、蛋白纯度鉴定报告
9、成品蛋白
(依据表达小试结果约定)

补充说明
1、不同的蛋白表达量差异很大,我们在小试阶段会交付尽可能多的目的重组蛋白。
2、正常情况下,我们使用Mouse-Anti-His抗体检测重组蛋白,如果选择不带标签,请提供特异性的抗体用于WB检测。
3、如果选择不携带任何标签,我们可以使用AKATA蛋白纯化设备分离目的蛋白,但是纯化费用会增加。
4、即使蛋白不表达或表达量极低,我们无法获得目的蛋白,我们也会提供全套的实验流程和原始照片。

哺乳动物细胞表达

哺乳动物细胞服务案例

本案例基于pMZ-X3分泌表达体系,使用基因合成的方法构建pMZ-X3表达载体,瞬时转染HEK293悬浮细胞,通过SDS-PAGE和Western Blot检测蛋白的表达情况,扩大培养收集细胞上清并通过Ni柱的亲和纯化获得目的蛋白。未经钟鼎生物授权,任何单位及个人不得转载或盗用,违者必究!

哺乳动物细胞蛋白表达订单前分析工作:
我们使用钟鼎生物专利的Codon_Score2.0软件分析待表达蛋白的基因序列,其中绿色是频率正常的密码子(使用频率>20%),灰色是使用频率低于20%的密码子,红色表示使用频率低于10%的密码子,针对HEK293宿主细胞优化基因序列。同时会对蛋白的亲疏水性和跨膜结构域分析,在不影响功能的基础之上,会选取部分或者全部的蛋白序列表达,制定表达成功率最高的实验方案。

哺乳动物细胞蛋白表达前分析

一、实验设计
我们分析客户提供的Target-Gene序列,整个蛋白序列呈亲水性,自身不带信号肽序列,因此我们设计思路为:
1.1、以客户的基因序列翻译的蛋白序列为源模板,通过密码子优化一套最适宜HEK293细胞系的基因序列。
1.2、推荐客户使用钟鼎生物的自主载体pMZ-3X载体来进行实验,利用载体自带的X3信号肽序列帮助蛋白穿膜分泌表达至胞外,为了保持蛋白的N端活性,我们在C端添加6XHis-Tag便于重组蛋白的检测和亲和纯化。
依据上述设计思路,以基因合成的方式构建pMZ-X3-target-gene表达质粒,经过测序和酶切验证无误后,挑取无内毒素的质粒。转染200ml HEK293细胞,通过western blot检测蛋白表达情况,确认蛋白表达情况,再通过Ni-resin亲和纯化获得80%以上目的蛋白。

二、试剂和耗材(略)

三、培养基配方如下(略)

四、主要实验仪器 (略)

五、实验方法及实验结果
5.1 pMZ-X3-gene表达质粒构建
采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成target-gene基因,双酶切连接至pMZ-X3载体的Afl II和Xba I之间;将获得的重组质粒转入TOP10克隆菌株,挑取阳性克隆子测序,测序结果拼接如下所示,单划线区为目的基因基因区域。紫色区域为酶切位点,黄色区域为X3信号肽,绿色区域为6XHis标签(序列略)

使用Chromas软件查看测序峰图文件,截取部分序列示例如下
哺乳动物表达质粒测序

测序拼接序列与理论序列相比对,结果显示获得序列与理论序列100%匹配,比对文件截图如下所示
哺乳动物表达质粒测序对比

pMZ-X3-gene质粒酶切图与载体构建示意图如下所示:

哺乳动物细胞293T瞬时表达载体构建及鉴定

5.2. 无内毒素质粒抽提
使用Sigma公司Endotoxin Free质粒重量抽提试剂盒抽提pMZ-X3-gene表达质粒,经LAL法测定<0.1EU/ug。
5.3. 待转染细胞预处理
转染前一天,将形态良好、生长旺盛处于对数生长期的HEK93T细胞用胰蛋白酶消化后稀释至4×105/mL的密度,接入24孔细胞培养板,轻微振荡使细胞均匀铺在细胞板孔内,每孔500ul,用DMEM高糖培养基培养和传代细胞。平放在37℃、5%二氧化碳培养箱中培养,待细胞长至80-90%汇合度时,可以开始转染操作。
5.4 细胞转染
取0.8ug质粒,加入50ul Optipro SFM,混匀后加入2ul 转染试剂,再次混匀后室温孵育20min。将DNA-转染试剂复合物滴加至24孔板中,轻轻混匀,37℃培养箱培养48h。
5.5 Western Blot检测培养上清
1. 样品上样0.01ug,上样完毕后,聚丙烯酰胺凝胶先90V跑完积层胶,再将电压升至200V直到电泳结束。电泳结束后,取下凝胶进行转膜,恒压100V转膜,约为1.5小时。取下膜后先用PBS洗涤4次,每次5分钟。然后置于5%脱脂奶粉封闭液中封闭37℃ 1小时。用封闭液稀释一抗,膜在一抗稀释液中37℃反应1小时。 洗膜4次,每次5 分钟;用含5%牛奶的封闭液稀释二抗。膜在二抗中37℃反应1小时,洗膜ECL显影。

哺乳动物细胞293细胞瞬时表达纯化

5.6 XX-His 融合蛋白的表达与纯化
5.6.1待转染细胞准备
将处于对数生长期的293T细胞用Trypsin消化后稀释至4×105/mL的密度,种于2L的滚瓶中。每个滚瓶加200ml DMEM高糖培养基(含3%胎牛血清),调节滚瓶转速至20转/小时,使细胞均匀贴到转瓶表面,约24小时左右,当细胞贴壁面汇合至90%时进行转染。
5.6.2 DNA预处理
取100ug无内毒素质粒,加入13ml OptiSFM,混匀后加入250ul 转染试剂,再次混匀后室温孵育20min。
5.6.3 细胞转染与表达
将DNA-转染试剂复合物滴加至滚瓶中,轻轻混匀,调节滚瓶转速20转/小时 ,37℃培养箱培养10个小时后换3% 血清的 DMEM中糖500ml,调节滚瓶转速40转/小时。表达4天后收取上清。
5.6.4 XX-His蛋白的纯化
将培养上清用0.22um滤膜过滤,滤液以0.5 mL/min的流速通过Ni层析柱;
50mM Tris-Hcl (PH=8.0,150mM NaCl)平衡层析柱,1ml/min;
50mM Tris-Hcl (PH=8.0,150mM NaCl)、50mM 咪唑洗杂,清洗10个柱体积,1ml/min;
50mM Tris-Hcl (PH=8.0,150mM NaCl)、250mM 咪唑洗脱,流速0.5ml/min。

6、蛋白质鉴定
对纯化后的蛋白,依据合同约定,进一步验证蛋白质的正确性,可选的方法有western blot, MS(分子量质谱),PFM(肽指纹图谱)具体的实验案例请参照对应的服务项目,此处省略。

补充说明:
我们使用哺乳动物细胞体系获得蛋白,一般情况下,我们会添加信号肽让剪辑成熟的蛋白分泌至培养基中,但是并非所有的蛋白都可以按照预期顺利的分泌或表达。在尊重科研事实的基础之上,我们无法承诺所有的蛋白都可以成功表达或以分泌的形式表达。我们也不承诺获的蛋白具有客户预期的生理学活性。

钟鼎生物资质

 

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